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撰文 | 咸姐
责编 | 兮
肿瘤的发生是一个多步骤的过程，在最初的癌细胞转化遇到瓶颈之后，它的最终生存依赖于它在有利的环境中定居的能力，而这种能力取决于一个极其复杂的体系，即“肿瘤生态系统”，它是肿瘤细胞在其微环境中与其他肿瘤细胞和宿主细胞的相互作用，并通过进化适应不断变化的环境的一个多样性群落。肿瘤周围的生态系统不仅促进了癌细胞的生长，也为它们提供了一个安全的“住所”，以克服免疫系统的攻击。在肿瘤发生过程中，具有基因异质性的不同的癌细胞的逐渐出现、进化，并与肿瘤微环境中的细胞相互作用，从而导致宿主代谢被劫持、免疫逃避、转移，以及最终死亡【1,2】。
肿瘤由多种细胞组成，不同区域的肿瘤细胞可以代表肿瘤生态系统的异质性，构成不同的肿瘤、间质和免疫细胞类型。在免疫系统和转化细胞之间存在着一种持续的竞争关系，是肿瘤细胞死亡或存活的重要原因。一种有利的肿瘤生态系统将有助于恶性细胞在营养缺乏和免疫力选择压力下存活。
此外，肿瘤生态系统细胞如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、内皮细胞（EC）和免疫细胞的异质性可进一步影响临床治疗反应。肿瘤异质性是许多癌症存在并存活的关键，对肿瘤的进展和治疗效果有着很大的影响【3,4】。而肝癌（HCC），作为全球癌症相关死亡的第二大原因，其高复发率与肿瘤异质性有着密切的关系。然而，在HCC生态系统中，定义瘤内异质性（ITH）的转录、空间和功能背景以及由此产生的独特的细胞间相互作用的系统研究仍难以实现。
与此同时，研究证实，肿瘤细胞表现出的表型可塑性有助于细胞多样性和肿瘤的进化。而胚胎发育和肿瘤发生之间存在相似性，表明肿瘤细胞可以重编程，或转分化为肿瘤干细胞样细胞（CSC）【5】。此外，一些恶性细胞可以表达胚胎发育特异性抗原，如HCC中表达的甲胎蛋白（AFP）【6】。这些研究将恶性肿瘤细胞的表型特征与早期胚胎发育程序联系起来，肿瘤细胞可以重现胚胎早期发育的特征。但是，肿瘤生态系统重现早期发育特征的能力到底如何也依旧未知。
基于以上问题，2020年9月24日，来自新加坡基因组研究院的Ramanuj DasGupta团队在Cell上在线发表题为“Onco-fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macrophages in Hepatocellular Carcinoma”的文章，绘制了一张人类肝脏从发育到疾病的单细胞图谱，揭示了一个可以同时驱动胎肝发育和HCC的免疫抑制的肿瘤-胚胎重编程生态系统，为HCC的治疗干预提供了新靶点。
为了解肝癌中肿瘤生态系统的复杂性以及恶性细胞、间质细胞和免疫细胞之间的动态相互作用，本文研究人员采用了基于微滴的单细胞转录组测序方法（图1）。首先，研究人员分析了来自14例HCC病人和1例正常人肝脏的57个区域的大约74000个细胞，鉴定出29个不同的主要聚类，分别代表上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。有趣的是，研究人员在HCC中观察到的肿瘤和癌旁组织的某些细胞类型的正常-特异性聚类，提示着肿瘤微环境（TME）可能发生了重塑。
除了观察到的正常和肿瘤生态系统之间的显著差异，研究人员也深入识别了疾病特异性细胞类型。这其中存在着患者特异性的肿瘤细胞聚类，由此强调了患者特异性的突变对上皮细胞转录组的主要影响，除此之外，在不止一个病人的结果中出现了一些亚群，表明肿瘤上皮细胞也具有共同的分子特征。
图1 单细胞测序示意图
从这个单细胞肝脏图谱获得的主要聚类中，在肿瘤和癌旁组织之间存在显著差异的两类细胞型是EC和巨噬细胞。因此，研究人员通过子聚类重新分析了EC和髓系亚群。EC可以分成11个聚类，其中10类是在正常或是在肿瘤组织中特异性表达的，尤其是PLPP3+、IGFBP3+和PLVAP+ EC在肿瘤组织中富集。其中，质膜囊泡相关蛋白（PLVAP）在肝脏发育和疾病中起着重要作用，RNA速率（RNA velocity）分析预测肿瘤特异性PLVAP+ EC可能来自中间的EC亚群。
与此同时，单核吞噬细胞（MNP）的子聚类分析发现肝脏中含有两个单核细胞聚类、三个树突状细胞聚类以及四个巨噬细胞聚类，其中前两类在正常组织中富集，而巨噬细胞主要存在于肿瘤中。
差异基因表达分析确定了TAM亚群的独特标记——表达TAM1的叶酸受体β（FOLR2）、骨桥蛋白（SPP1）阳性的TAM2和富含金属硫蛋白1G（MT1G）的TAM3。RNA速率分析发现HCC中的两类FOLR2+ TAM1来源不同，一类来源于单核细胞，而另一类似乎是胚胎来源的驻留于组织中的巨噬细胞（TRM）。
有趣的是，单核细胞来源的FOLR2+聚类显示了更高的HES1表达，意味着Notch信号可能在TAM1亚群的出现中发挥作用。由此表明在HCC中，单核细胞来源的巨噬细胞可能被重编程以获得与胚胎类似的表型。而流式细胞术和RNA荧光原位杂交技术均证实了单细胞测序图谱的结果，建立了内皮和巨噬细胞群的特异性标记物，提示在HCC中存在着胚胎相关的PLVAP+ EC和胚胎样FOLR2+ TAM1。
随后，研究人员对16周和21周估计胎龄（EGA）的人胎肝组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），并将其与HCC-scRNA-seq数据进行了聚合。单细胞图谱显示胚胎肝细胞和肿瘤内皮细胞以及髓细胞之间显著的相似性。
最重要的是，研究人员发现PLVAP+ EC主要富集于胚胎和肿瘤组织中，而在正常内稳态细胞中缺失，由此进一步证实了在HCC中PLVAP+ EC发生类似胚胎发育的重编程的可能性。而对MNP的分析也揭示了类似的惊人发现，在HCC中出现胚胎肝脏相关的FOLR2+巨噬细胞的特异性富集。
而对小鼠肝细胞、人类胚胎肝脏以及肿瘤巨噬细胞的跨物种比较分析更清晰地表明HCC中FOLR2+ TAM1与胚胎来源的巨噬细胞具有显著相似性，表明HCC中TAM的胚胎样重编程。
进一步地，研究人员通过NicheNet分析（可以通过连接配体和靶基因表达来预测细胞间的相互作用）表明VEGF信号对胚胎肝脏和HCC中PLVAP+ EC出现的重要性以及其可能促进TME肿瘤-胚胎重编程。
而为了揭示正常和肿瘤生态系统中受体-配体相互作用，研究人员进行了细胞-细胞相互作用分析（CellPhoneDB），表明TAM1可以促进HCC的免疫抑制微环境的形成。
值得注意的，TAM1（CD163+）、Treg（TIGIT+）细胞以及PLVAP+ EC共定位于相同的位置，接近于ALB+肿瘤上皮细胞群，并且在PLVAP高密度区域出现CD163+和TIGIT+细胞的富集，提示TAM1主要定位于肿瘤免疫优势部位的血管周围。
与此一致的是，研究人员同时观察到TIGIT+细胞在FOLR2+ TAM1的富集。由此进一步证明了肿瘤生态系统中FOLR2+ TAM1、Treg和肿瘤-胚胎EC之间的关系。
此外，针对小鼠胚胎移植肝脏、人类胚胎肝脏和TAM1巨噬细胞的保守的单细胞基因调控网络（GRN）分析表明，不同的FOLR2+ TAM1集群可能代表着细胞状态（单核细胞来源的重编程和TRM），而不是细胞类型，因此提示HCC中TAM的肿瘤-胚胎重编程。而PLVAP+ EC可以促进TAM1中Notch信号的激活，从而促进微环境介导的肿瘤-胚胎重编程。
综上所述，本文描绘了一个全面的单细胞人类肝脏图谱，以了解从胚胎发育到肝癌的整体细胞背景。发现在胎肝和TEM之间的共同的细胞类型、转录程序、GRN和信号通路，首次揭示了胚胎肝脏发育和HCC生态系统之间的共享程序——肿瘤-胚胎重编程，同时表明VEGF/NOTCH信号通路在维持HCC免疫抑制的肿瘤-胚胎生态系统中的重要作用。本文的发现不仅为HCC的治疗干预提供了新的靶点，也可以作为HCC免疫治疗的潜在生物标志物，同时也为识别和理解其他癌症中类似的机制开辟了道路。
制版人：琪酱
参考文献
1. Xianwen Ren, Boxi Kang, Zemin Zhang. Understanding tumor ecosystems by single-cell sequencing: promises and limitations.Genome Biol. 2018; 19: 211.
2. Eric A. Smith, H. Courtney Hodges. The spatial and genomic hierarchy of tumor ecosystems revealed by single-cell technologies.Trends Cancer. 2019; 5(7): 411–425.
3. Tabassum, D.P., and Polyak, K. Tumorigenesis: it takes a village.Nat. Rev. Cancer. 2015; 15, 473–483.
4. McGranahan, N., and Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.Cell. 2017; 168, 613–628.
5. Hans Clevers. The cancer stem cell: premises, promises and challenges.Nat Med. 2011; 17(3):313-9.
6. Behne, T., and Copur, M.S. Biomarkers for hepatocellular carcinoma.Int. J. Hepatol.2012, 859076.
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